【技術文章】細胞養不好？這些注意事項請收好（三）

1、購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？細胞冷凍管解凍后，為何會有細胞數目太少的情形？

研究人(ren)員在細(xi)(xi)胞(bao)培養時出(chu)現存(cun)活率不佳(jia)，常見原因(yin)可歸納為：培養基(ji)使(shi)用錯(cuo)誤或(huo)培養基(ji)品(pin)質不佳(jia)；血清使(shi)用錯(cuo)誤或(huo)血清的(de)品(pin)質不佳(jia)；解凍(dong)過(guo)程錯(cuo)誤；冷凍(dong)細(xi)(xi)胞(bao)解凍(dong)后，加以洗滌細(xi)(xi)胞(bao)和離心；懸浮細(xi)(xi)胞(bao)誤認(ren)為死(si)細(xi)(xi)胞(bao)；培養溫(wen)度使(shi)用錯(cuo)誤；細(xi)(xi)胞(bao)置于 –80 ℃ 太久。

研(yan)究人員在冷凍(dong)細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)時(shi)出現細(xi)(xi)胞(bao)數目太(tai)少(shao)，大(da)都是因為離心過程操(cao)作上(shang)的(de)失(shi)誤(wu)，造成細(xi)(xi)胞(bao)的(de)物理(li)性(xing)損(sun)傷，以(yi)及細(xi)(xi)胞(bao)流失(shi)。建議細(xi)(xi)胞(bao)解凍(dong)后不要立刻離心，應待(dai)細(xi)(xi)胞(bao)生長隔夜后再更換培養(yang)基即可。

2、收到(dao)的(de)冷凍管瓶(ping)(ping)身(shen)破裂，瓶(ping)(ping)蓋有裂紋，或(huo)瓶(ping)(ping)蓋脫落的(de)原因？

冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)瓶(ping)蓋裂紋，或瓶(ping)身破(po)裂，可能(neng)是(shi)因為操作者夾取(qu)冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)時用力不當，造成(cheng)冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)裂損，建議(yi)使用止血鉗小心夾取(qu)。另(ling)冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)瓶(ping)蓋松動或松脫，是(shi)因熱(re)脹冷(leng)(leng)縮的(de)物理現象，冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)有可能(neng)因此(ci)而造成(cheng)細胞污染，故冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)于放(fang)入(ru)和取(qu)出液(ye)氮桶時，均應立刻將(jiang)冷(leng)(leng)凍(dong)管(guan)(guan)(guan)再(zai)一次扭緊。

3、如(ru)何(he)選用(yong)特殊(shu)細胞系(xi)培(pei)養基(ji)？

培(pei)養(yang)某一類(lei)型細(xi)胞沒有(you)固定的培(pei)養(yang)條件。在 MEM 中(zhong)培(pei)養(yang)的細(xi)胞，很(hen)可能在 DMEM 或 M199 中(zhong)同樣很(hen)容易生長。總之，選 MEM 做粘(zhan)附(fu)細(xi)胞培(pei)養(yang)，RPMI-1640 做懸浮細(xi)胞培(pei)養(yang)是一個好的開始(shi)，各種目的無血清培(pei)養(yang)shou選 AIM V（12005）培(pei)養(yang)基（SFM）。

4、L-谷氨酰(xian)胺在細(xi)胞培養中重要嗎(ma)？它在溶液中不(bu)穩(wen)定嗎(ma)？

L-谷(gu)氨酰(xian)胺(an)在細(xi)(xi)胞培養(yang)時(shi)(shi)是重要的(de)。脫(tuo)掉(diao)氨基后(hou)(hou)，L-谷(gu)氨酰(xian)胺(an)可作為培養(yang)細(xi)(xi)胞的(de)能量來源、參與蛋白質的(de)合成和核酸代(dai)謝。L-谷(gu)氨酰(xian)胺(an)在溶液中經(jing)過一段時(shi)(shi)間(jian)后(hou)(hou)會(hui)降(jiang)(jiang)解(jie)，但是確(que)切的(de)降(jiang)(jiang)解(jie)率一直沒有終定論。L-谷(gu)氨酰(xian)胺(an)的(de)降(jiang)(jiang)解(jie)導致(zhi)氨的(de)形成，而氨對(dui)于(yu)一些(xie)細(xi)(xi)胞具有毒性。

5、GlutaMAX-I 是(shi)什么？培養(yang)細胞如何(he)利用(yong) GlutaMAX-I？這個(ge)二(er)肽有多穩定？

GlutaMAX-I 二(er)肽是一(yi)個 L-谷氨酰(xian)胺(an)的衍生物(wu)，其不穩定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸(suan)來保護。一(yi)種肽酶逐漸裂(lie)解二(er)肽，釋放 L-谷氨酰(xian)胺(an)供利用。GlutaMAX-I 二(er)肽非常穩定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘(zhong)，GlutaMAX-I 二(er)肽溶液有(you)小的降解，如果在相同條件(jian)下，L-谷氨酰(xian)胺(an)幾乎*降解。

6、什么培(pei)養基中(zhong)可以(yi)省去加(jia)酚(fen)紅？培(pei)養基中(zhong)丙酮酸鈉的作(zuo)用是什么？

酚(fen)紅(hong)在(zai)培(pei)養(yang)(yang)基中被(bei)用(yong)(yong)來(lai)作(zuo)為(wei)(wei) PH 值(zhi)的(de)指示(shi)劑：中性(xing)時(shi)為(wei)(wei)紅(hong)色，酸性(xing)時(shi)為(wei)(wei)黃色，堿性(xing)時(shi)為(wei)(wei)紫色。研究表明，酚(fen)紅(hong)可以模擬固醇類激(ji)素的(de)作(zuo)用(yong)(yong)（特別是雌(ci)激(ji)素）。為(wei)(wei)避免固醇類反應，培(pei)養(yang)(yang)細胞，尤(you)其(qi)是哺(bu)乳類細胞時(shi)，用(yong)(yong)不加(jia)酚(fen)紅(hong)的(de)培(pei)養(yang)(yang)基。由于(yu)酚(fen)紅(hong)干(gan)擾檢測，一些研究人員(yuan)在(zai)做流式細胞檢測時(shi)，不使用(yong)(yong)加(jia)有(you)酚(fen)紅(hong)的(de)培(pei)養(yang)(yang)基。

丙(bing)酮酸鈉可以作為細胞(bao)培養中(zhong)的(de)替代(dai)碳源，盡管細胞(bao)更傾向(xiang)于以葡(pu)萄(tao)糖(tang)作為碳源，但是，如果沒(mei)有(you)葡(pu)萄(tao)糖(tang)的(de)話，細胞(bao)也可以代(dai)謝丙(bing)酮酸鈉。

7、為什(shen)么(me)目錄上說 Hank's 平(ping)衡鹽(yan)溶液 （HBS） 在空氣(qi)中使用，不需要 CO2 培養箱？HBS 和(he) Earle's 平(ping)衡鹽(yan)溶液 （EBS） 有什(shen)么(me)本質的功能差別？

HBS 和 EBS 的(de)(de)主要(yao)差別(bie)在(zai)于碳(tan)酸(suan)氫鈉的(de)(de)水平(ping)，在(zai) Eagles （2.2 g/L） 中比在(zai) Hanks （0.35 g/L） 中高。碳(tan)酸(suan)氫鈉需用高水平(ping)的(de)(de) CO2 平(ping)衡，以維(wei)持溶液(ye)的(de)(de) PH 值。Eagles 液(ye)在(zai)空氣水平(ping)的(de)(de) CO2 中，溶液(ye)會變堿，Hanks 液(ye)在(zai) CO2 培(pei)養(yang)箱中會變酸(suan)。如果(guo)希望(wang)在(zai) CO2 培(pei)養(yang)箱中保存組織(zhi)，需要(yao)用 Eagles 液(ye)，如果(guo)僅僅是清洗(xi)將要(yao)在(zai)細胞培(pei)養(yang)基中儲(chu)存的(de)(de)組織(zhi)，用 Hanks 液(ye)就可以了。

8、二價離子抑(yi)制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shi)加入(ru) EDTA 的目的是什(shen)么(me)？

二價離子的(de)確抑制(zhi)胰(yi)蛋(dan)白酶活(huo)性(xing)。EDTA 用(yong)來螯合游離的(de)鎂離子和鈣(gai)離子，以便保持抑制(zhi)胰(yi)蛋(dan)白酶的(de)活(huo)性(xing)。建(jian)議胰(yi)蛋(dan)白酶處理細(xi)胞前(qian)，用(yong) EDTA 清(qing)洗細(xi)胞，以消(xiao)除(chu)來自(zi)培養基中所有(you)的(de)二價離子。

9、其他注意事項

o 當在無(wu)血(xue)清(qing)培養基中添加抗生(sheng)素(su)時，降(jiang)低(di)至(zhi)少在有(you)血(xue)清(qing)培養基中所使用濃度的(de) 50%。血(xue)清(qing)蛋(dan)白會結合和滅活一些(xie)抗生(sheng)素(su)。在無(wu)血(xue)清(qing)培養條件下(xia)，抗生(sheng)素(su)不被(bei)滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

o 一旦您(nin)在新鮮培養基中(zhong)(zhong)添(tian)加了血清和(he)抗生(sheng)素時，您(nin)應該(gai)在兩到三周內使用它。因為一些抗生(sheng)素和(he)血清中(zhong)(zhong)的(de)基本成分在解(jie)凍后(hou)就開始降解(jie)。

o 大(da)部(bu)分添加物和(he)試劑多(duo)可以凍融(rong) 3 次(ci)，如果次(ci)數更多(duo)都(dou)會(hui)在包含蛋白的溶(rong)液(ye)引起一(yi)定水(shui)平的降解和(he)沉淀，將會(hui)影響它的性能(neng)。

o 在溶解(jie)的一(yi)周內使用(yong)貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能(neng)開(kai)始降解(jie)，如果在室溫下(xia)放置超過 30 分鐘(zhong)，就會(hui)變得不穩定。

o 為了保持 CO2 培養箱水(shui)盤清潔，需定期 （至(zhi)少每(mei)兩周一次） 用無(wu)菌蒸餾水(shui)或(huo)無(wu)菌去離子水(shui)更換(huan)。