細胞的(de)復蘇及凍存方法

一(yi). 細胞復蘇(su)與培養
將液(ye)氮或(huo)- 80℃ 保存(cun)的(de)腫瘤細胞于 37℃ 水浴(yu)，快(kuai)速溶化，用 8.0ml 培(pei)(pei)(pei)養基(ji)混勻已融(rong)化的腫(zhong)瘤細胞(bao)懸液，于 1500 轉/ 分，離(li)心 3 分鐘。 棄上清，再吸取(qu) 8.0ml 培(pei)(pei)(pei)養基(ji)質(zhi)混勻細胞(bao)沉淀，再 1500 轉/ 分，離(li)心 3 分鐘，棄上清，細胞(bao)沉淀用 1.0ml 培(pei)(pei)(pei)養基(ji)混勻，備(bei)用。 另(ling)取(qu)一個 75cm2 方瓶，加入(ru)(ru) 14.0ml 培(pei)(pei)(pei)養基(ji)質(zhi)，將上述制備(bei)的含 腫(zhong)瘤細胞(bao)懸液（1.0ml）加入(ru)(ru)此(ci)方瓶中(zhong)，于 37℃，5%CO2 孵(fu)育箱中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養。
若此(ci)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)懸浮(fu)生長(chang)，大約 3－4 天(tian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)基(ji)(ji)質會變(bian)(bian)黃，5.0ml 細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)懸液可(ke)(ke)傳代(dai)(dai)一個(ge)(ge)方瓶(ping)(ping)(ping)培(pei)養，可(ke)(ke)用(yong)(yong) 3－4 個(ge)(ge)方瓶(ping)(ping)(ping)培(pei)養，一個(ge)(ge)方瓶(ping)(ping)(ping)中(zhong)呈(cheng)對(dui)數生長(chang)的(de)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)(ke)達 1-1.5×107 個(ge)(ge)，根據試驗所需，可(ke)(ke)決(jue)定傳代(dai)(dai)的(de)次(ci)數。 若此(ci)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)呈(cheng)貼壁生 長(chang)，經過 3-4 天(tian)，腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生長(chang)至 80%-95% 單層時(shi)，棄上(shang)清，用(yong)(yong) 0.5mM 的(de)EDTA（難(nan)消化(hua)的(de)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)用(yong)(yong)0.25%胰(yi)酶1.0ml），處(chu)理腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)大約 3-5 分(fen)鐘，用(yong)(yong)倒置顯微(wei)鏡觀(guan)察，當 90% 的(de)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)變(bian)(bian)圓時(shi)，即可(ke)(ke)用(yong)(yong)彎管吹打并(bing)將消化(hua)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉(zhuan)移到(dao) 15ml 離心管中(zhong)，于 1500 轉(zhuan)/ 分(fen)下(xia)，離心 3 分(fen)鐘，棄上(shang)清，加少許培(pei)養基(ji)(ji)混勻，可(ke)(ke)傳代(dai)(dai) 3 個(ge)(ge) 75cm2 方瓶(ping)(ping)(ping)擴(kuo)大培(pei)養。

二. 細胞凍(dong)存
將對數生長的腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)用(yong) 1 個 75cm2 方瓶按(an)上述(shu)方法收集(ji)，于 1500 轉/分離心 3 分鐘，棄上清(qing)，用(yong)保種液(ye)(ye)（ 含 10% DMSO 的小牛血(xue)清(qing)）3.0ml 混勻，分別加入到 2-3 只保種管(guan)中(zhong)，寫上腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)名稱、時(shi)間、保種者姓名，放(fang)- 80℃ 保存(cun)，次日將它們轉移到液(ye)(ye)氮中(zhong)保存(cun)（ 注： -80℃ 下可(ke)保存(cun)細胞(bao)半(ban)年至一年，液(ye)(ye)氮可(ke)保存(cun)細 胞(bao) 5-10 年，甚至更長的時(shi)間）。以(yi)上所(suo)(suo)有物(wu)品(pin)均需經過(guo)高溫滅菌(jun) （ 121℃，30 分鐘） ，培(pei)養(yang)基質則(ze)經過(guo)過(guo)濾（0.22uM）除菌(jun)，所(suo)(suo)有操作均必(bi)須遵守(shou)無菌(jun)操作技術，避免細菌(jun)、真(zhen)菌(jun)、病原(yuan)體(ti)(ti)、衣(yi)原(yuan)體(ti)(ti)等污染。