凍存和復蘇的原則：慢凍快融

當(dang)細(xi)(xi)胞(bao)冷到零度以下(xia)，可以產生以下(xia)變化：細(xi)(xi)胞(bao)器(qi)脫水，細(xi)(xi)胞(bao)中可溶性(xing)物質濃(nong)度升高，并(bing)在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)內形(xing)成冰(bing)晶。

如果(guo)緩慢冷凍，可使細(xi)胞(bao)逐步脫水，細(xi)胞(bao)內不致產生大(da)(da)的(de)冰晶(jing)(jing)；相(xiang)反，結(jie)晶(jing)(jing)就(jiu)大(da)(da)，大(da)(da)結(jie)晶(jing)(jing)會(hui)造成細(xi)胞(bao)膜、綱(gang)胞(bao)器的(de)損(sun)傷和破裂。復蘇過程(cheng)應快融(rong)，目的(de)是防止小(xiao)冰晶(jing)(jing)形(xing)成大(da)(da)冰晶(jing)(jing)，即冰晶(jing)(jing)的(de)重結(jie)晶(jing)(jing)。

慢凍程序

1. 標(biao)準(zhun)程序(xu)：采用(yong)細(xi)胞凍存器

當(dang)溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；

當(dang)溫度(du)達-25 ℃以下(xia)時， 5~10 ℃/min；

當溫度達-100℃時(shi)，可迅速(su)放入液氮中。

2. 簡易程序：將冷凍管（管口(kou)(kou)要(yao)朝上）放(fang)入(ru)紗布(bu)袋內，紗布(bu)袋系以線繩，通過線繩將紗布(bu)袋固(gu)定于(yu)液氮(dan)(dan)罐罐口(kou)(kou)，按每分鐘(zhong)溫(wen)度下降(jiang)1~2 ℃的(de)速(su)度，在40 min內降(jiang)至液氮(dan)(dan)表面過一晚，次晨投人液氮(dan)(dan)中。

3. 傳統程序：冷凍管置于4℃ 10 分(fen)鐘(zhong)→ -20℃ 30 分(fen)鐘(zhong)→ -80℃ 16~18 小時（或隔(ge)夜） → 液(ye)氮(dan)槽(cao)長期儲(chu)存(cun)。

細胞凍存方法

1. 預先配制凍存液(ye)

（1）10%DMSO + 細胞生(sheng)長液(ye)（20%血(xue)清+基礎培養液(ye)）

2. 取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細胞懸液（1×10⁶ ~ 5 ×10⁶細胞/ml）。

3. 加入1 ml細(xi)(xi)胞(bao)于凍(dong)存(cun)管中，密(mi)封(feng)后(hou)標記冷凍(dong)細(xi)(xi)胞(bao)名稱(cheng)和(he)冷凍(dong)日期。液氮長期保存(cun)。

保存細胞的復蘇方法

1. 快速解凍

凍存細胞從液氮中(zhong)取出(chu)后，立(li)即放入37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分(fen)鐘內全部融化（不要超過3 分(fen)鐘）。

2. 解凍后的細胞(bao)可直接(jie)(jie)接(jie)(jie)種到含*生長培(pei)養(yang)液(ye)的細胞(bao)培(pei)養(yang)瓶中直接(jie)(jie)進行(xing)培(pei)養(yang)，24小(xiao)時后再(zai)用新鮮(xian)*培(pei)養(yang)液(ye)替換舊培(pei)養(yang)液(ye)，以去除DMSO。

3. 如(ru)果(guo)細胞(bao)對冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)護劑特別敏感解(jie)凍(dong)(dong)后(hou)的細胞(bao)應(ying)先通過離(li)心去除(chu)冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)護劑，然后(hou)再接種到含*生長(chang)培養(yang)液(ye)的培養(yang)瓶中。