注意：冷凍保(bao)存的細胞非常脆弱。將小瓶置于37°C水(shui)浴融化細胞，然后盡快移(yi)入(ru)培(pei)養物(液(ye))中，盡量減少操作(zuo)。

準備

1.準備纖維(wei)連接蛋白(bai)(bai)包(bao)被的(de)培(pei)養(yang)瓶(2 μg /cm2，推薦用T-75的(de)培(pei)養(yang)瓶)。向(xiang)培(pei)養(yang)瓶中加(jia)入10 ml無(wu)菌Dulbecco's磷酸(suan)鹽(yan)緩沖液（DPBS），然(ran)后加(jia)入150 μl 纖維(wei)連接蛋白(bai)(bai)原液(1 mg/ml, Sigma cat. no. F1141)。將培(pei)養(yang)瓶放入培(pei)養(yang)箱中孵育。

2.準(zhun)備*培養(yang)(yang)基(ji)：用(yong)70%的酒精消(xiao)毒(du)培養(yang)(yang)基(ji)和添(tian)加物的外表面，然后放到(dao)無菌(jun)的地方。在無菌(jun)環境(jing)下打開每(mei)一(yi)個添(tian)加物管并用(yong)吸管將其加入到(dao)基(ji)本(ben)(ben)培養(yang)(yang)基(ji)中。以(yi)保(bao)證(zheng)添(tian)加物全部加入基(ji)本(ben)(ben)培養(yang)(yang)基(ji)中。

3.吸出纖維連(lian)接蛋白溶(rong)液并向瓶內(nei)加入20 ml*培(pei)養(yang)基(ji)。將培(pei)養(yang)瓶放入超凈(jing)臺(tai)中，然(ran)后(hou)準備融化細胞。纖維連(lian)接蛋白溶(rong)液可以使用兩次(ci)。

4.將小(xiao)(xiao)瓶(ping)放(fang)入(ru)37°C水浴中，握(wo)住并(bing)輕(qing)輕(qing)旋轉小(xiao)(xiao)瓶(ping)直到其內(nei)細胞*融化(hua)。將小(xiao)(xiao)瓶(ping)立刻移出水浴，擦干(gan)，用70%的酒精(jing)沖洗小(xiao)(xiao)瓶(ping)，然后放(fang)到無菌(jun)環境中。小(xiao)(xiao)心地打開(kai)蓋子，注意(yi)手指不(bu)要碰(peng)到里面的螺紋。eppendorf吸管輕(qing)輕(qing)重(zhong)懸管內(nei)容(rong)物。

5.將管內容物均勻(yun)的(de)(de)放(fang)入纖維連接(jie)蛋(dan)白(bai)包被的(de)(de)培養瓶中。推(tui)薦(jian)的(de)(de)接(jie)種密度為7,500 cells/cm2。

注(zhu)(zhu)意：不推薦在細(xi)(xi)胞融(rong)化后進(jin)行稀釋和離心，因為這些操作比培養基中的(de)DMSO殘留物對細(xi)(xi)胞的(de)傷害更大(da)。需要注(zhu)(zhu)意的(de)是，內皮細(xi)(xi)胞接(jie)(jie)種在纖維連接(jie)(jie)蛋(dan)白包被的(de)培養瓶(ping)中能夠(gou)促(cu)進(jin)細(xi)(xi)胞的(de)帖壁。

6.蓋(gai)好培養瓶的蓋(gai)子，輕輕地搖動培養瓶以使細胞分布(bu)均勻(yun)，如需氣體(ti)交換(huan)則適當放(fang)松(song)瓶蓋(gai)。

7.將培養(yang)瓶放入(ru)培養(yang)箱中。

8.為了得到良好的結果，在培養開始后至少16個小時內不要動培養物。第二天更換培養基以去除殘留的DMSO和未貼壁的細胞，然后每隔一天進行如上操作。培養良好的細胞將呈現鵝卵石形或紡錘體形，細胞質無顆粒且細胞數量在培養2-3天后會倍增。[2] 

培養的維持

1.應用冰凍(dong)的(de)細(xi)胞構建(jian)培養物(wu)(wu)后(hou)，可于次(ci)日早晨更(geng)換新鮮的(de)含有添加物(wu)(wu)的(de)培養基(ji)。隨后(hou)的(de)傳代培養中(zhong)，每隔48小時更(geng)換一次(ci)培養基(ji)。

2.此后每(mei)隔一天(tian)更換一次(ci)培(pei)養(yang)基，直到細胞約達到50%融合。

3.一(yi)旦細(xi)胞達(da)到(dao)(dao)50%融(rong)合，則(ze)要每天更換(huan)培養基直到(dao)(dao)細(xi)胞大(da)約達(da)到(dao)(dao)90%融(rong)合。

傳代培養：

1.細胞達到90%融合(he)時進行(xing)傳代培養。

2.傳(chuan)代培養的前(qian)一天準備纖維連接蛋白包被的培養瓶(2 μg/cm2)。

3.將(jiang)培(pei)養基，胰酶/EDTA消(xiao)化液，胰酶中(zhong)和液和DPBS(磷酸鹽緩沖液) 加熱(re)至(zhi)室溫。我(wo)們不(bu)推薦在使用(yong)(yong)前用(yong)(yong)37°C水浴加熱(re)試劑和培(pei)養基。

4.用DPBS沖洗細胞(bao)。

5.用10 ml胰(yi)酶/EDTA消(xiao)化(hua)液消(xiao)化(hua)細(xi)胞(以T-75培養瓶(ping)為例)，直到80%細(xi)胞呈現圓形(在顯微鏡(jing)下觀察)。立刻加入10 ml 胰(yi)酶中(zhong)和液并輕輕搖動培養瓶(ping)。

注意(yi)：應用ScienCell研究室的胰酶/EDTA消化液(ye)能使由于過度消化導致的細胞死(si)亡降(jiang)到zui小(xiao)程度。

6.收取(qu)細(xi)胞(bao)并將其移入(ru)50ml離心管中。另外用(yong)10ml生長培養(yang)基沖洗培養(yang)瓶以收集殘留(liu)的細(xi)胞(bao)。在(zai)顯微鏡下觀察剩余(yu)細(xi)胞(bao)數量(liang)以確(que)定(ding)是否收集成(cheng)功(gong)。剩余(yu)細(xi)胞(bao)數應小于5%。

7.以1000轉/分(fen)（1000rpm）離心收(shou)取的細胞懸液5分(fen)鐘，然后(hou)在生長培(pei)養(yang)基中重懸細胞。

8. 計(ji)數細胞(bao)，然后將它們以推薦的細胞(bao)密度接(jie)種(zhong)在新的纖維(wei)連接(jie)蛋白包被過的培養(yang)瓶中(zhong)

注意：

處(chu)理人類來(lai)(lai)源(yuan)的(de)(de)(de)產品(pin)存(cun)在潛(qian)在的(de)(de)(de)生物風(feng)險。盡管每一株細胞經檢(jian)測(ce)為艾滋病病毒(du)(du)，乙(yi)肝病毒(du)(du)，丙肝病毒(du)(du)陰性，但檢(jian)測(ce)并(bing)不能(neng)達(da)到100%準確(que)，因此，必須采(cai)取(qu)適當的(de)(de)(de)保護措(cuo)施(shi)以避(bi)免無意中(zhong)的(de)(de)(de)暴露。操作這些產品(pin)時請帶手(shou)套和(he)安全鏡(jing)。不要用嘴吸。我們推(tui)薦采(cai)用通用的(de)(de)(de)程序來(lai)(lai)處(chu)理人源(yuan)性產品(pin)，從(cong)而達(da)到以zui小(xiao)的(de)(de)(de)預防來(lai)(lai)對抗污染。