細(xi)胞介紹

該細胞來源于人靜脈(mo)內皮(pi)，可在半固體培養基(ji)中(zhong)形成克隆，在免疫(yi)抑制小鼠中(zhong)不能(neng)形成腫(zhong)瘤。

細胞特性

1） 來(lai)源(yuan)：人臍帶組織

2） 形(xing)態：內皮細胞樣 貼(tie)壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shu)

4） 規格(ge)：T25瓶或(huo)者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供(gong)科(ke)研(yan)使用。

運輸和(he)保(bao)存

干冰(bing)運輸及(ji)復蘇(su)好存(cun)活細胞

（1）1mL凍存管包(bao)裝干冰運輸，收到后(hou)-80度冰箱保存過夜后(hou)轉入液氮(dan)或直(zhi)接復蘇，若發現(xian)干冰已揮(hui)發干凈、凍存管瓶蓋脫落(luo)、破損及細(xi)胞有(you)污染，請立(li)即與我們聯(lian)系。

（2）T25瓶(ping)復蘇的存活細(xi)胞常(chang)溫(wen)發(fa)貨，收到(dao)后按(an)照細(xi)胞接(jie)收后的處理方法操作。

細胞接收后(hou)的處理

1）收到細(xi)胞(bao)(bao)后，75%酒精消(xiao)毒瓶(ping)壁將T25瓶(ping)置(zhi)于37℃培養箱(xiang)放置(zhi)約2-3h，若發現培養瓶(ping)破損、有液溢出及細(xi)胞(bao)(bao)有污(wu)染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀胰蛋白態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為時收到時細胞狀態的依據。

3）貼(tie)壁細(xi)(xi)胞：細(xi)(xi)胞在37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)(zhong)(zhong)放置2-3h，顯微鏡下(xia)觀察細(xi)(xi)胞的(de)生(sheng)長和貼(tie)壁情況，有些貼(tie)壁細(xi)(xi)胞在快遞運送過程中(zhong)(zhong)(zhong)會因振動脫落和脫落后成團的(de)情況。若鏡下(xia)觀察細(xi)(xi)胞的(de)生(sheng)長密度若在60%以下(xia)，可去(qu)除(chu)培(pei)養瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)灌液培(pei)養基（若有未貼(tie)壁的(de)細(xi)(xi)胞需(xu)要離心回(hui)(hui)收，重懸打入(ru)到原培(pei)養瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)）,加(jia)入(ru)新(xin)配制的(de)完(wan)培(pei)養基6-8mL，放到細(xi)(xi)胞培(pei)養箱(xiang)中(zhong)(zhong)(zhong)繼續培(pei)養。若細(xi)(xi)胞生(sheng)長密度達70%-80%以上，可以對細(xi)(xi)胞進行傳(chuan)代處理。傳(chuan)代過程中(zhong)(zhong)(zhong)，若因運輸振動脫落的(de)細(xi)(xi)胞需(xu)要離心回(hui)(hui)收。

                   

一．培養(yang)基及培養(yang)凍存條(tiao)件準備(bei)：

1）準備(bei)內皮(pi)細胞培(pei)養體系        

內皮細胞培(pei)養基礎培(pei)養基                   93%

胎(tai)牛血清（FBS）                                5%

內皮(pi)細胞培養添加劑                           1%

清(qing)霉(mei)素/連霉(mei)素，P/S                             1%

2）培(pei)養條件： 氣相：空氣，95%；二氧(yang)化(hua)碳，5%。 溫度：37攝氏度，培(pei)養箱(xiang)濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二、細(xi)胞處理(li)：

1） 凍存細胞的復蘇：

將(jiang)含(han)有1mL細(xi)胞懸液的凍(dong)存管在37℃水(shui)浴中迅速(su)搖(yao)晃(huang)解凍(dong)，加入到含(han)4-6mL完培(pei)養(yang)(yang)基(ji)的離(li)心(xin)管中混合均勻(yun)。在1000RPM條件下(xia)離(li)心(xin)3-5min，棄去上清(qing)液，完培(pei)養(yang)(yang)基(ji)重懸細(xi)胞。然(ran)后將(jiang)細(xi)胞懸液加入含(han)6-8ml完培(pei)養(yang)(yang)基(ji)的培(pei)養(yang)(yang)瓶（或皿）中37℃培(pei)養(yang)(yang)過夜。第二天顯微鏡下(xia)觀察細(xi)胞生長(chang)情況(kuang)和細(xi)胞密度(du)。

2） 細胞傳(chuan)代(dai)：如(ru)果(guo)細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan)代(dai)培養。

對于貼壁(bi)細胞傳代可(ke)以(yi)參考以(yi)下方法：

1. 棄(qi)去培養上清(qing)，用不含鈣、鎂離(li)子的(de)PBS潤(run)洗細胞1-2次。

2. 加入(ru)0.25％（w / v）胰儀蛋 白 酶-0.53 mM EDTA于培(pei)養(yang)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置(zhi)于37℃培(pei)養(yang)箱中消(xiao)化(hua)(hua)(hua)1-2分鐘（難消(xiao)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)細(xi)胞可以適當延長消(xiao)化(hua)(hua)(hua)時間），然后在(zai)顯微鏡下觀察(cha)細(xi)胞消(xiao)化(hua)(hua)(hua)情況，若(ruo)細(xi)胞大(da)部分變圓并脫落，迅速拿(na)回操作臺，輕(qing)敲幾下培(pei)養(yang)瓶后加入(ru)3-4ml含10%FBS的(de)(de)培(pei)養(yang)基來終止消(xiao)化(hua)(hua)(hua)。

3.輕輕打(da)勻后吸出，在1000RPM條件(jian)下離心3-5min，棄去(qu)上清液，補加(jia)1-2mL培養(yang)液后吹(chui)勻。將細(xi)胞懸(xuan)液按1：2的(de)比例(li)分到新T25瓶中，添加(jia)6-8ml按照說明(ming)書要求配(pei)置的(de)新的(de)完培養(yang)基以保持細(xi)胞的(de)生長活力，后續傳代(dai)根據實際情況按1:2~1:5的(de)比例(li)進行。

3）細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun): 收到細(xi)胞(bao)后(hou)建議在(zai)培養前3代時(shi)凍(dong)存(cun)一批細(xi)胞(bao)種子以備后(hou)續(xu)實驗使用。

下面T25瓶(ping)為例；

1. 細(xi)胞(bao)(bao)凍(dong)存時按(an)照細(xi)胞(bao)(bao)傳代的過程(cheng)收集消化好的細(xi)胞(bao)(bao)到離心(xin)管(guan)中，可使用血(xue)球(qiu)計數板計數，來決定細(xi)胞(bao)(bao)的凍(dong)存密度。一般細(xi)胞(bao)(bao)的推薦凍(dong)存密度為1×10^6~1×107個活細(xi)胞(bao)(bao)/ml.

2. 1000rpm離(li)心3-5min，去掉上清。用配(pei)制好的細(xi)胞(bao)凍(dong)(dong)存(cun)液重懸細(xi)胞(bao) ，按(an)每1ml凍(dong)(dong)存(cun)液含1×10^6~1×107個活細(xi)胞(bao)/ml分(fen)配(pei)到一個凍(dong)(dong)存(cun)管中(zhong)將細(xi)胞(bao)分(fen)配(pei)到凍(dong)(dong)存(cun)管中(zhong)，標注好名(ming)稱、代數(shu)、日期等信(xin)息(xi)。

3. 將要凍存的(de)細胞(bao)置于(yu)程序(xu)降溫盒(he)中，-80度冰(bing)箱中過夜，之(zhi)后轉入液(ye)氮容器中儲存。同(tong)時記錄(lu)好凍存管在(zai)液(ye)氮容器中的(de)位置以便后續查(cha)閱和使用(yong)。