細胞培養注意事項（入門級）

總(zong)的(de)原則：無菌操(cao)作、保證細胞培養環境的(de)穩定性

按時間順序整理

1、  細胞房(fang)和生物安(an)全柜（或超(chao)凈工作臺）先開紫外(wai)照射30min。作用(yong)：對(dui)環境滅菌（空氣）。（備(bei)注：如果著急，至少(shao)也要(yao)開15分鐘）

在做實驗(yan)之(zhi)前考慮(lv)好需(xu)要(yao)哪些物(wu)(wu)品(pin)(pin)。開始照射之(zhi)前，將所(suo)需(xu)要(yao)用到的(de)物(wu)(wu)品(pin)(pin)都放到生(sheng)物(wu)(wu)安全柜（或超凈工作臺）里面。

常用移液槍(qiang)或電動移液器等，需要在工作臺(tai)上放置(zhi)一(yi)套設備。

細胞培養(yang)箱一般都已經調整好(hao)。定(ding)期留意一下二氧化碳是(shi)否足夠。不夠及時更換。

2、  顯(xian)微鏡需要定(ding)期消毒酒精(jing)擦拭。注意(yi)：顯(xian)微鏡一般(ban)都放在細胞房。

3、  進入(ru)實驗之前(qian)，首先(xian)給自己帶上(shang)拖鞋(xie)、頭套(tao)(tao)，口(kou)罩，實驗服(fu)，手(shou)套(tao)(tao)（手(shou)套(tao)(tao)帶雙層(ceng)）。注意：手(shou)套(tao)(tao)要將(jiang)袖口(kou)套(tao)(tao)進去。實驗服(fu)、拖鞋(xie)是細胞房(fang)。

4、  開始操作之前先觀察細胞。

首先觀察(cha)細胞(bao)培(pei)養液(ye)(ye)的顏色(se)。現在的細胞(bao)培(pei)養液(ye)(ye)通常(chang)都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅(hong)）。細胞(bao)在培(pei)養生長過(guo)程(cheng)中(zhong)，不斷在培(pei)養液(ye)(ye)上清中(zhong)累(lei)積酸性物質，時間(jian)長了，培(pei)養液(ye)(ye)變為黃色(se)（同時培(pei)養液(ye)(ye)中(zhong)營養物質耗盡(jin)）。

其(qi)次鏡下觀察細(xi)胞的生長狀態是否良(liang)好，是否需要(yao)傳(chuan)代(dai)。如果生長狀態不好，需要(yao)對(dui)培養液進行調整（一般是加大(da)(da)血清濃度(du)）。過于密(mi)集出現大(da)(da)片(pian)融合或(huo)太(tai)密(mi)集而導致細(xi)胞脫落，則進行傳(chuan)代(dai)。

如果長勢良好，且細胞培養液顏色(se)未(wei)發(fa)生(sheng)(sheng)變(bian)化，可以(yi)酌情(qing)進行1/2、 1/3、1/4換(huan)液，也(ye)可以(yi)全(quan)換(huan)液。總之，視(shi)細胞生(sheng)(sheng)長情(qing)況而(er)定。

5、  細(xi)胞(bao)培養預準備：

首先(xian)是準備各(ge)種溶液。

1：是配制溶(rong)液過程中要用(yong)到的水。水用(yong)純水，高壓滅(mie)菌之后，再去(qu)內毒(du)(du)素(su)(su)。去(qu)內毒(du)(du)素(su)(su)方(fang)法很多，簡(jian)單可(ke)以放在烘箱180度(du)3小時。或者(zhe)過去(qu)內毒(du)(du)素(su)(su)的柱(zhu)子后，高壓滅(mie)菌。

第二，各種溶液(ye)滅菌(jun)：

抗生(sheng)素(su)用去內毒素(su)水配制后(hou)，直(zhi)接過(guo)濾(lv)除菌（過(guo)0.22u濾(lv)頭）。可以用一次性(xing)無菌注射器過(guo)一次性(xing)0.22u濾(lv)頭。

現在用(yong)(yong)的培(pei)養(yang)液，如(ru)果是商業化(hua)液體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)，不用(yong)(yong)處理。如(ru)果是粉末，需要用(yong)(yong)去內(nei)毒素水在生物(wu)安全柜(ju)（或超(chao)凈工作臺）進行配制(zhi)，再過(guo)濾除菌(jun)。可以先配濃(nong)縮液（如(ru)10×），過(guo)濾除菌(jun)后(hou)。再用(yong)(yong)滅菌(jun)去內(nei)毒素水稀(xi)釋成(cheng)1×培(pei)養(yang)液。

第(di)三(san)，*培養液的(de)配(pei)制：

培(pei)養液(ye)加上合適比例的(de)血清(qing)(qing)即可。但血清(qing)(qing)一(yi)般(ban)保存于－20℃，一(yi)般(ban)解(jie)凍是放在(zai)4℃冰箱解(jie)凍，耗(hao)時長(chang)，而(er)且必須(xu)解(jie)決*之后，才能進行*培(pei)養基(ji)的(de)配制(zhi)。所以(yi)要提(ti)前幾個(ge)小時就將血清(qing)(qing)從－20℃轉入4℃，以(yi)期*解(jie)凍。當然(ran)如果這(zhe)一(yi)次就需要用完的(de)話(hua)（是指用這(zhe)些血清(qing)(qing)配制(zhi)的(de)培(pei)養液(ye)都(dou)用完），也可以(yi)放到37℃解(jie)凍。

第四(si)，醉重要的是保證過程(cheng)中無菌。

液(ye)體必須要分(fen)裝。無論過程(cheng)中用到(dao)的培養液(ye)、胰酶、血清、PBS、生(sheng)理鹽水、抗生(sheng)素盡量分(fen)裝。分(fen)裝是為了防止(zhi)污染。如果操作(zuo)有誤，僅能(neng)威脅到(dao)其中一(yi)支，而非整(zheng)個。

培養液、血清、PBS、生(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)分裝(zhuang)為20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

分裝先于細胞操作

第五，操作之(zhi)前，培養液先放到37度的細(xi)胞培養箱里復(fu)溫。原因：盡量減少(shao)對細(xi)胞的刺激。低溫對于細(xi)胞也是一個刺激因素。

第(di)六，操(cao)作(zuo)(zuo)之(zhi)前，大(da)腦(nao)先過一遍(bian)此次操(cao)作(zuo)(zuo)所需要用(yong)到的所有(you)(you)用(yong)具。將所有(you)(you)用(yong)具先放到無(wu)菌臺面上。減(jian)少拿入拿出的動作(zuo)(zuo)，保證無(wu)菌。（如果萬一發現少拿了(le)什么，也不要緊，再加(jia)上就是。如果是槍頭盒、移液管等(deng)用(yong)具，先用(yong)消毒酒(jiu)精噴一下(xia)）。

第(di)七，操作之(zhi)前，帶著的(de)手套先噴消毒酒(jiu)精。然后再(zai)(zai)進(jin)入工作臺。等一(yi)分鐘，等手套上的(de)酒(jiu)精揮發之(zhi)后再(zai)(zai)進(jin)行操作。

6、  細胞(bao)培養操作過程：

注意無菌(jun)(jun)。無論哪一(yi)管液體(ti)，開(kai)蓋后盡量立即關(guan)上(shang)（如果有幾瓶都(dou)需要(yao)開(kai)的(de)，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上(shang)放(fang)。操(cao)作時不要(yao)從開(kai)蓋的(de)容器上(shang)方經過。另外，無菌(jun)(jun)臺面上(shang)擺(bai)放(fang)的(de)各種東西(xi)，是一(yi)字擺(bai)開(kai)，平行于自己。盡量不要(yao)前(qian)后重疊

細胞操作中所(suo)用(yong)的所(suo)有耗材試劑都是細胞培養。一般都以(yi)一次(ci)性耗材居多。1ML槍頭為加長(chang)型培養槍頭。移液管亦有10mL一次(ci)性無菌移液管

（1）細胞換液：

培(pei)養皿/瓶用槍頭(tou)或移(yi)液(ye)(ye)管吸去原培(pei)養液(ye)(ye)，加入新培(pei)養液(ye)(ye)。

（2）細胞傳代：

傳(chuan)代之(zhi)前先觀察，細胞(bao)是(shi)否密集，是(shi)否開始融(rong)合(he)。一般(ban)融(rong)合(he)達到(dao)70－80%就可以傳(chuan)代。早(zao)點(dian)傳(chuan)代也可以。

如果(guo)是(shi)貼壁生長的細胞：

1）  ;培(pei)養(yang)皿/瓶用槍頭或(huo)移液(ye)管吸去原培(pei)養(yang)液(ye)；

2）  無菌PBS或無菌生理鹽水洗(xi)滌3次（按培(pei)養(yang)體積加入）；

3）  加入適量胰(yi)酶消(xiao)化適當(dang)時間(jian)（一(yi)般胰(yi)酶為0.25%；9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，一(yi)次加入1mL胰(yi)酶。消(xiao)化時間(jian)視細胞類型等多種(zhong)情況綜合考慮，一(yi)般如(ru)果是細胞株，非原代(dai)培養，消(xiao)化1－2分鐘足矣）；

4）  用槍(qiang)頭吹(chui)打數(shu)十次(ci)（視細胞類型而(er)定。一般(ban)細胞株30－50次(ci)吧(ba)，耗(hao)時一般(ban)2分鐘左右）；

5）  加入適(shi)量體(ti)積*培(pei)養(yang)基終止胰酶消化(hua)（如(ru)果是9cm/10cm培(pei)養(yang)皿(min)(min)和25cm培(pei)養(yang)瓶(ping)，可以(yi)加入1mL*培(pei)養(yang)基；現在培(pei)養(yang)瓶(ping)（皿(min)(min)）里有(you)2mL溶液）。

6）  現在可(ke)以(yi)將(jiang)溶液(ye)進(jin)行分(fen)瓶（2mL）。如果是細胞株，直接均分(fen)到兩個培養(yang)瓶（皿）里。如果是原代培養(yang)，可(ke)以(yi)根據消化時間(jian)來對細胞進(jin)行分(fen)離；因此(ci)可(ke)以(yi)將(jiang)溶液(ye)（2mL）都轉入新(xin)的培養(yang)瓶（皿）。

7）  將兩個(ge)培(pei)養(yang)瓶(ping)（皿）補足*培(pei)養(yang)基到(dao)正常體積（果是9cm/10cm培(pei)養(yang)皿和(he)25cm培(pei)養(yang)瓶(ping)，為5mL*培(pei)養(yang)液）

8）  鏡下觀(guan)察。剛剛傳代細胞(bao)還沒貼壁，懸浮在(zai)溶液(ye)中，呈圓形。一(yi)般2h之內(nei)會貼壁，如果已經(jing)貼壁，根據細胞(bao)類型有不同的形態，但通常都(dou)不是圓形。

9）  鏡下(xia)觀察無誤之(zhi)后(hou)，再放入細胞培養箱。培養瓶（皿）放入之(zhi)前，可以用消毒酒精(jing)先擦(ca)一下(xia)。

10）  傳代(dai)之后，第二天細(xi)胞(bao)換(huan)液一次(ci)。當(dang)然，也可(ke)以視情況而定(ding)。

7、  收拾(shi)工(gong)作(zuo)臺。物品歸位，倒出垃圾。再開紫(zi)外照射(she)30min

8、  其它注意事項：

1:，經常(chang)觀察(cha)。是每天(tian)(tian)都(dou)顯(xian)微鏡下看一看，確定細(xi)(xi)胞狀態。然后該換液換，該傳代傳，不(bu)用理(li)會的就原樣放(fang)回去。如果好幾天(tian)(tian)都(dou)不(bu)想理(li)會，可(ke)以放(fang)不(bu)*培養基，或者(zhe)低血(xue)清濃(nong)度的培養液，維持細(xi)(xi)胞生(sheng)存(cun)，但不(bu)增殖。

第二，是(shi)否加(jia)(jia)抗生(sheng)(sheng)素(su)。這(zhe)個視情況(kuang)而定。細(xi)胞培養過程中，是(shi)要(yao)求盡量少添加(jia)(jia)不相關(guan)的雜質。抗生(sheng)(sheng)素(su)對于細(xi)胞來說，也是(shi)一種負(fu)擔。但如(ru)果環(huan)境比較污染，直接添加(jia)(jia)好(hao)了。好(hao)比沒病不用吃藥(yao)，感冒(mao)了還是(shi)要(yao)吃藥(yao)；嬰(ying)兒沒病但還是(shi)要(yao)打疫苗。

第三，胎(tai)牛(niu)血(xue)清的解凍。血(xue)清一般保存(cun)于－20℃，要放(fang)(fang)(fang)在4℃冰箱(xiang)解凍，耗(hao)時長，500mL要好幾(ji)個小時，我(wo)們經(jing)(jing)常是頭(tou)天離開實驗室之前(qian)放(fang)(fang)(fang)到4℃冰箱(xiang)，過夜。所以(yi)經(jing)(jing)常分(fen)裝成10mL或者20mL。這樣，上午放(fang)(fang)(fang)到4℃冰箱(xiang)，下午就可以(yi)用了。

第二(er)，是(shi)否(fou)一定要細(xi)胞房。以(yi)及(ji)是(shi)否(fou)要*嚴格的遵守(shou)種(zhong)(zhong)(zhong)種(zhong)(zhong)(zhong)器(qi)具。這個(ge)吧，見(jian)仁見(jian)智。凡(fan)所有(you)種(zhong)(zhong)(zhong)種(zhong)(zhong)(zhong)措施及(ji)設備都是(shi)為了(le)保證培養操(cao)作(zuo)過程中無菌(jun)，減(jian)少感染的機率；試(shi)劑耗(hao)材(cai)保證無菌(jun)無內毒素。細(xi)胞房也是(shi)這么(me)(me)一個(ge)措施而已，其它(ta)試(shi)劑耗(hao)材(cai)也是(shi)；我們沒有(you)專門的細(xi)胞房也這么(me)(me)養。

并不是(shi)說走(zou)夜(ye)路就一定會遇(yu)(yu)到鬼，當然走(zou)多了遲早遇(yu)(yu)到，如果總是(shi)遇(yu)(yu)不到，這(zhe)個(ge)人運氣一定很好(hao)——。

剛開始我們實驗室(shi)也是(shi)(shi)沒(mei)有的生物(wu)安全(quan)柜(ju)和細胞房，拖鞋什(shen)么的也沒(mei)辦法(fa)，沒(mei)有加抗(kang)生素，照樣養得(de)好(hao)好(hao)的。但(dan)是(shi)(shi)，交(jiao)叉養，還是(shi)(shi)需要(yao)(yao)注意，一是(shi)(shi)時間上分(fen)隔開來：每(mei)天細胞培養先(xian)操作。其它細菌之類(lei)操作靠后，且操作后消毒酒(jiu)精臺(tai)面消毒，紫外照射1小時。二是(shi)(shi)其它操作要(yao)(yao)小心，避(bi)免帶(dai)入(ru)污染。當然，如果有必要(yao)(yao)加抗(kang)生素，還是(shi)(shi)盡早加，比(bi)細胞污染了再去搶救要(yao)(yao)來得(de)好(hao)。

（算(suan)是順便(bian)整理了一(yi)下，屬于入門級別的(de)。）

@geraldorjerry：你好，你的(de)意思是(shi)紫外(wai)線照過之(zhi)后(hou)，實驗(yan)操作開始了，如(ru)果萬一(yi)(yi)發現少拿了什么，就直接酒精噴一(yi)(yi)下再放進(jin)去是(shi)嗎

@llh1245：有(you)時確(que)實是(shi)(shi)忘(wang)記(ji)，ZUI怕的(de)就(jiu)是(shi)(shi)那種實驗(yan)(yan)已經(jing)做到一(yi)(yi)半忘(wang)記(ji)了(le)的(de)，或(huo)者發現(xian)東(dong)西(xi)(xi)不夠用的(de)。我們一(yi)(yi)般是(shi)(shi)這(zhe)樣處理：耗材、移液槍還(huan)有(you)金屬器皿(min)之類的(de)，可(ke)以噴一(yi)(yi)下酒精(jing)放進來，等酒精(jing)風干(gan)一(yi)(yi)下，注意不要(yao)和其它(ta)東(dong)西(xi)(xi)混(hun)雜。反正(zheng)一(yi)(yi)般細胞的(de)也有(you)外包裝，里面已經(jing)是(shi)(shi)無(wu)(wu)菌(jun)無(wu)(wu)內毒素。如果是(shi)(shi)試劑(ji)，那就(jiu)是(shi)(shi)直接從冰箱拿出來放進來就(jiu)是(shi)(shi)。（如果只是(shi)(shi)實驗(yan)(yan)還(huan)沒有(you)真(zhen)的(de)開(kai)始，把漏掉(diao)的(de)東(dong)西(xi)(xi)加上，再照(zhao)30分鐘就(jiu)是(shi)(shi)。）

@姚麗佳：請(qing)問傳代前，經(jing)過胰酶處理(li)后(hou)(hou)，加(jia)了培養基后(hou)(hou)不用離心直接分瓶(ping)嗎？那后(hou)(hou)面培養的時候不就含有胰蛋白酶了嗎？不會產生影響(xiang)嗎？

@llh1245：是(shi)(shi)的，不(bu)用離心(xin)直(zhi)接(jie)分瓶。之后加(jia)入含(han)血清的培養(yang)基中止了(le)胰酶作(zuo)用。如果(guo)是(shi)(shi)貼壁細胞，一般第(di)二天(tian)就貼壁了(le)。分瓶后第(di)二天(tian)再全(quan)部(bu)換液(ye)。如果(guo)是(shi)(shi)半懸(xuan)浮(fu)細胞，一般都(dou)不(bu)用胰酶消(xiao)化，都(dou)是(shi)(shi)直(zhi)接(jie)吹下(xia)來。