來(lai)自ATCC的(de)細胞培養指南（精簡版）

每(mei)天(tian)對待細胞那(nei)真是捧在手里(li)怕碎了，含在嘴里(li)怕化了，看在眼里(li)怕丟了。如果手里(li)有一份來(lai)自機構ATCC的《細胞培(pei)養(yang)指(zhi)南》，養(yang)細胞可就得(de)心應手多了。下面是(shi)細胞培(pei)養(yang)指(zhi)南（精簡版），值(zhi)得(de)收藏。

   綜述

細胞(bao)(bao)要(yao)么在培養瓶表面(mian)貼(tie)壁(bi)生(sheng)長(chang)（錨定依(yi)(yi)賴性）要(yao)么懸浮生(sheng)長(chang)（非錨定依(yi)(yi)賴性）。細胞(bao)(bao)的生(sheng)長(chang)和(he)分裂，通常遵循一個由四個階段組成的特征性增長(chang)模式：停滯期，對數期（指(zhi)數期），平穩期（平臺(tai)期）和(he)衰退期。

停滯期(qi)——將細胞接(jie)種(zhong)至培養瓶之后，細胞逐步(bu)恢(hui)復(fu)的同時，緩慢(man)生長。

對數(shu)期（指數(shu)期）——細胞(bao)進入一(yi)(yi)個對數(shu)生(sheng)長(chang)的時期，一(yi)(yi)直持續到整個生(sheng)長(chang)表面被占滿或細胞(bao)密度超過培養基提供營養的能(neng)力。

平(ping)穩期——細胞增殖減(jian)慢(man)或停止。

衰退(tui)期——如果不更(geng)換培(pei)養基且細胞數量(liang)不減少，細胞活力會下(xia)降(jiang)，并出(chu)現細胞死(si)亡。

為了確保活力，遺傳穩(wen)定(ding)性和表型穩(wen)定(ding)，必(bi)須使細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)保持在(zai)對數期。這意(yi)味(wei)著細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)需要(yao)(yao)在(zai)進入(ru)平穩(wen)增長(chang)階(jie)段之(zhi)前，或(huo)在(zai)單(dan)層細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)長(chang)成(cheng)100%融(rong)合之(zhi)前，或(huo)在(zai)懸(xuan)浮(fu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)達到推薦(jian)的(de)最大(da)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)密度之(zhi)前定(ding)期進行(xing)傳代培養。為每個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系繪制(zhi)生長(chang)曲線，對于測(ce)定(ding)該(gai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系的(de)生長(chang)特性是(shi)必(bi)要(yao)(yao)的(de)。

~凍存細胞復蘇(su)~

培(pei)養一個新的(de)(de)細(xi)胞時要特別(bie)注意培(pei)養基(ji)一致性的(de)(de)問題。雖然大多數細(xi)胞系可以在不(bu)(bu)止一種培(pei)養基(ji)中生長(chang)，但是(shi)當培(pei)養基(ji)改變(bian)(bian)時，細(xi)胞的(de)(de)性質(zhi)也(ye)會變(bian)(bian)化。來自于不(bu)(bu)同廠家的(de)(de)培(pei)養基(ji)，即使名(ming)字相同或(huo)類似，配方(fang)(fang)也(ye)略有差異。仔(zi)細(xi)閱讀說明書，配方(fang)(fang)，標(biao)簽，確(que)保使用正(zheng)確(que)的(de)(de)培(pei)養基(ji)。

細胞復(fu)蘇(su)時，應以(yi)最(zui)快速度融化(hua)凍存(cun)的細胞溶液，然后(hou)迅速與*培(pei)養基混(hun)合(he)(he)，并接種(zhong)到合(he)(he)適的細胞瓶中。

復蘇程序

1) 準(zhun)備細胞培(pei)養容器（如T-75細胞瓶），加入至少10 ml適當(dang)的(de)培(pei)養基，并平衡溫度(du)及pH。

2) 從(cong)液(ye)氮罐(guan)中(zhong)取出(chu)凍存管，并在37℃（或適合該(gai)細胞的溫度）水浴中(zhong)緩慢搖(yao)動至冰晶(jing)*融化（約2 min），注意解凍過(guo)程要迅(xun)速(su)。

3) 從水(shui)浴中取出(chu)凍(dong)存(cun)管，浸(jin)泡或者噴撒(sa)酒(jiu)精消毒。后續的操作，需在(zai)無菌操作臺中，并(bing)保證嚴格無菌。

4) 擰開凍存(cun)管(guan)蓋，將(jiang)細(xi)(xi)胞懸(xuan)液轉移至含有9ml*培養基(ji)的無菌離(li)心管(guan)中(zhong)。溫和離(li)心(125g×10min)，棄(qi)去(qu)上清去(qu)除凍存(cun)保護劑。注意(yi)不要擾動(dong)細(xi)(xi)胞層。加入1-2 ml*培養基(ji)重(zhong)懸(xuan)細(xi)(xi)胞，緩慢(man)吹打(da)使細(xi)(xi)胞團變(bian)松散。將(jiang)細(xi)(xi)胞懸(xuan)液轉移至含培養基(ji)的容器中(zhong)充分混合(he)。

5) 24小時(shi)后，檢測細胞狀(zhuang)態。

細胞傳(chuan)代培養~

單層貼壁細胞的傳代培養

為了保證(zheng)單層貼壁細胞(bao)的對數(shu)生長，需要定(ding)期(qi)傳代(dai)(dai)。當細胞(bao)生長接近指數(shu)生長后期(qi)(匯合率大約70%到90%)，準備傳代(dai)(dai)。針對傳代(dai)(dai)過程，ATCC提(ti)供的產品說明(ming)中(zhong)，會推薦細胞(bao)傳代(dai)(dai)分(fen)配比(bi)例和補充培養基策略。

單(dan)層貼壁細(xi)(xi)胞(bao)傳代，需要打(da)斷細(xi)(xi)胞(bao)之間(jian)的(de)連(lian)接(jie)。對(dui)于比較松散的(de)連(lian)接(jie)，猛擊(ji)培(pei)養(yang)瓶側壁，可以分(fen)離細(xi)(xi)胞(bao)。很多情況下，需要/EDTA的(de)蛋白水解(jie)酶來消化(hua)。對(dui)于一些細(xi)(xi)胞(bao)系，需要采(cai)用(yong)刮等機械方法分(fen)離細(xi)(xi)胞(bao)。細(xi)(xi)胞(bao)分(fen)離成為單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)懸液后，稀釋到適當(dang)的(de)密度并轉移(yi)到新的(de)培(pei)養(yang)瓶中，在適當(dang)的(de)生長培(pei)養(yang)基(ji)中，細(xi)(xi)胞(bao)將再貼壁生長和分(fen)裂。

由(you)于每(mei)種細胞都(dou)是的，孵化時間和溫(wen)度、清洗次(ci)數或溶液配方可能(neng)會(hui)有所不(bu)同。分離過程中，應用顯微鏡密切觀(guan)察細胞(bao)(bao)，以防(fang)止細胞(bao)(bao)損(sun)傷。這(zhe)個過程根(gen)據(ju)容器使用合(he)適的培養體積。

懸浮細胞的傳代(dai)培養(yang)

相對(dui)于單層貼壁細胞(bao)(bao)來(lai)說，懸浮細胞(bao)(bao)的傳代(dai)更具(ju)有優勢，單層貼壁細胞(bao)(bao)需(xu)要(yao)蛋白水解酶，會(hui)造成細胞(bao)(bao)損傷。而(er)懸浮細胞(bao)(bao)可以使用稀釋的方法來(lai)傳代(dai)，細胞(bao)(bao)生長沒有延遲，對(dui)實驗室空間要(yao)求較(jiao)小，傳代(dai)培(pei)養(yang)是線(xian)性放大的。比(bi)如細胞(bao)(bao)可以在(zai)發酵罐中培(pei)養(yang)。

根據細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型，懸浮培(pei)養(yang)接(jie)種(zhong)密度從(cong)2×10*4至5×10*5活細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)/ml。收獲時細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)密度2×10*6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)/ml。如(ru)(ru)果細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)接(jie)種(zhong)密度過(guo)低，他(ta)們(men)將(jiang)經(jing)歷增(zeng)長(chang)延遲階段(duan)，增(zeng)長(chang)非常緩慢甚至*死亡。如(ru)(ru)果細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)密度過(guo)高，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可能(neng)耗盡(jin)培(pei)養(yang)基(ji)中營(ying)養(yang)，而突

~細胞(bao)凍(dong)存~

隨著細(xi)胞(bao)被(bei)冷凍至冰點(dian)以下，懸液(ye)中冰晶(jing)和溶質的(de)濃度有所增加。如果冷卻過(guo)程中，胞(bao)內水分(fen)可以滲出細(xi)胞(bao)，則可以減少胞(bao)內冰晶(jing)。通常(chang)1℃/min的(de)降(jiang)溫(wen)速度可以促進此過(guo)程。但(dan)是，水分(fen)的(de)喪失會導致細(xi)胞(bao)收縮(suo)，當這(zhe)種收縮(suo)達到一定程度，又會導致細(xi)胞(bao)活性(xing)的(de)劇烈下降(jiang)。冷凍保(bao)護劑，如甘(gan)油或者(zhe)二甲(jia)基(ji)亞(ya)砜（DMSO），可以緩解(jie)這(zhe)種效應(ying)。細(xi)胞(bao)凍存的(de)標準程序是在含有冷凍保(bao)護劑的(de)培養基(ji)中，將(jiang)細(xi)胞(bao)緩慢冷凍至–70℃，然(ran)后將(jiang)凍存管轉(zhuan)移到液(ye)氮中以保(bao)持低于–130℃的(de)環境。

有(you)很多方法可以(yi)實現1℃/min的(de)降溫(wen)速度。電(dian)腦(nao)控制的(de)可編程電(dian)子降溫(wen)系統是(shi)好的(de)方式，可(ke)以精(jing)確保持(chi)降溫(wen)速度(du)。這也是(shi)ATCC采用的(de)(de)(de)方法(fa)。但這種設(she)備(bei)價格較(jiao)高。比較(jiao)經濟的(de)(de)(de)方式是(shi)將(jiang)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)管(guan)放置(zhi)于凍(dong)(dong)存(cun)(cun)盒(he)中(zhong)，在低于–70℃的(de)(de)(de)冰(bing)箱中(zhong)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)24小(xiao)時。之后再轉移至液氮長期(qi)儲存(cun)(cun)。

以下程(cheng)序適用于(yu)大多數(shu)細胞(bao)(bao)。凍(dong)存培養基的配方請參考細胞(bao)(bao)說明書。凍(dong)存時，細胞(bao)(bao)應處(chu)于(yu)指數(shu)生長期(qi)。

凍存程序

1) 凍存前先(xian)檢測細(xi)胞是(shi)否(fou)受(shou)到細(xi)菌、真菌、支原體和病毒的污染。如(ru)果確定有(you)污染，應將(jiang)該細(xi)胞銷(xiao)毀。

2) 凍存(cun)培養(yang)基由*培養(yang)基和5%D